茶多酚对皮肤角朊细胞生长与凋亡的影响

摘　要：为探讨茶叶中的重要活性成分茶多酚对皮肤角朊细胞的生长周期动力学和对细胞凋亡的影响，在原代培养大鼠皮肤角朊细胞基础上，根据培养基中乳酸脱氢酶释放情况确定的茶多酚浓度范围，采用细胞计数法和流式细胞仪研究角朊细胞的生长、周期动力学和凋亡发生率。结果发现，在一定浓度范围内(0.1～1.0g/L)，茶多酚可以促进角朊细胞生长。在细胞周期动力学上，表现为促进细胞从G1期和静止期(G0)转向有丝分裂合成期S和G2／M期，增殖指数(PI)也从18.17%增至25.62%；同时细胞凋亡发生率从27.10%下降到17.97%。表明茶多酚可以促进皮肤角朊细胞有丝分裂和生长，减少细胞凋亡发生。关键词：茶多酚　角朊细胞　皮肤　凋亡分类号：S571.1　R739.5　R730.1　文献标识码：A文章编号：1000-8020(2000)02-0094-03 Effects of tea polyphenols on cell kinetics and apoptosisof primary cultured rat skin keratinocytes Fu Yicai　Wei Shaomin　Lin Huifen　Zhang Ying，et al.（Unit of Skin Physiology and Dermatotoxicology， Preventive Medicine Institute，Shanghai Medical University， Shanghai 200032，China） Abstract：In order to study the effects of tea polyphenols on cell growth and apoptosis of primary cultured rat skin keratinocytes， the safe dosage of tea polyphenols was determined by the release of lactate dehydrogenase(LDH). Cell counting(cytometry) and flow cytometry(FCM) were used to estimate the cell growth and the percentages of cells in different cell cycle phases or apoptosis. The results showed that tea polyphenols stimulated the cell growth from G1／G0 to G2／M phase， enhanced the synthesis of DNA(increase S phase) and increased the proliferative index(PI) from 18.17% to 25.62%. Also， it could block the occurrence of apoptosis. It is concluded that tea polyphenols could stimulate the growth of skin keratinocytes through stimulating the synthesis of cell DNA and inhibiting apoptosis.Key words：tea polyphenols， keratinocyte， skin， apoptosis

　　茶多酚是茶叶中的重要活性成分，由于其独特的生物学活性，越来越受到人们重视。许多研究表明茶多酚在体外可清除自由基和抗脂质过氧化，甚至可以增强小鼠的许多生理功能［1～3］，其抑制肿瘤的作用也越来越受到广泛关注，抑制皮肤肿瘤发生的研究也日益深入［4～6］。另外，某些化妆品生产厂家试图利用茶多酚清除自由基和抗脂质过氧化等重要生物活性作用，将其添加到护肤品中以增加化妆品的功效和作用，并宣称添加了茶多酚的化妆品具有延缓皮肤衰老的作用［7］，但是其确切效果尚缺乏科学实验的论证。 1　材料与方法 1.1　茶多酚

　　浙江大学食品科技系由绿茶分离与提纯，淡黄褐色，有效浓度>40%。用不含血清的DMEM培养基配成适当浓度，抽滤灭菌于4℃冰箱中保存待用。 1.2　皮肤角朊细胞的培养

　　根据Yin的方法稍加修改［8］，取3日龄SD大鼠的背部皮肤，去除皮下脂肪，置4℃冰箱中半小时后加入0.25%胰酶(美国Dibco公司)，于37℃恒温箱中热消化2小时。然后在4℃PBS中漂洗3次，用含15%小牛血清(NBS，华美公司)的DMEM培养液(美国Gibco公司)中和胰酶。分离表皮与真皮，将表皮层角朊细胞(基底细胞)刷下，并用10%的聚蔗糖(ficoll)(瑞典Pharmacia公司)进行密度梯度离心。计数细胞，用K-SFM培养基(美国Gibco公司)将细胞密度调整至1×106／ml，接种于35mm塑料培养皿(美国Corning公司)。12小时第1次换液，然后每2～3天换液。 1.3　角朊细胞胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放水平的测定

　　当上述培养细胞生长至70%融合时，加入茶多酚(不含NBS的DMEM配制)。根据LDH还原NAD的能力，于加样后12、24小时测定LDH［9］，以选择可能具有促进角朊细胞生长的合适的茶多酚剂量范围。 1.4　细胞生长情况测定

　　当细胞生长接近融合状态时，去除培养液，用PBS洗涤。加入含0.01mol/L EDTA的胰酶(0.25%)1ml，37℃温箱中10分钟左右，当部分细胞脱落时，倾去胰酶，加入含15%NBS的培养液1.5ml，轻轻吹打，并将细胞团块打散。然后加入1滴0.4%台盼蓝(美国Chroma公司)染液，在细胞计数板上计数着色与未着色细胞。分别求出不同茶多酚浓度下细胞增殖分裂后引起的细胞增加百分数(与对照组相比的细胞增长百分数，定义为增长率)。 1.5　细胞周期动力学与细胞凋亡的测定

　　培养的角朊细胞加入茶多酚后24小时，用胰酶消化收集细胞。2×106个细胞用75%酒精固定，用0.1% triton 100漂洗离心7分钟，沉淀物用0.1% RNase处理(37℃ 30分钟)。用0.05%碘化丙啶染色DNA，用EPICS VI流式细胞仪测定DNA含量与分布［8］，确定有丝分裂不同细胞周期(G1、S、G2、M)细胞的百分含量及细胞凋亡发生率。并计算出增殖指数(PI，可综合反映细胞的增殖分裂能力)，PI=［(S+G2／M)／(G0／G1+S+G2／M)］×100%。 2　结　果 2.1　茶多酚对皮肤角朊细胞LDH释放的影响

　　分别在加入茶多酚后12和24小时，取细胞培养上清液0.5ml测定LDH。发现随着茶多酚浓度升高，LDH释放逐渐降低。茶多酚1 g/L时达到最低值；而浓度继续升高，LDH水平反而升高(表1)。表1　茶多酚对培养的皮肤角朊细胞乳酸脱氢酶释放水平的影响(±s，n=6) U／L 茶多酚(g/L) 12小时 24小时 0 937.92±69.07 1　027.53±　72.93 0.1 988.38±85.21 1　122.52±　59.76 0.5 875.72±23.56(1) 883.62±113.12(1) 1.0 725.43±30.45(2) 706.73±　93.97（2） 5.0 919.33±92.63 1　126.77±　38.79(1)

　　注：与对照组相比 (1)P<0.05，(2)P<0.01 2.2　茶多酚与皮肤角朊细胞生长的关系

　　随着茶多酚浓度增加，角朊细胞存活率从91.25%增加至93.82%。细胞生长增殖研究发现：随着茶多酚浓度增加，角朊细胞增长率由1.24%增加到5.25%(表2)。表2　茶多酚对皮肤角朊细胞生长状况影响(±s，n=4)　% 茶多酚(g/L) 活细胞百分数细胞增长率 0 91.25 1.00 0.05 91.31 1.24±0.75 0.1 91.91 1.32±0.84 0.5 93.03 2.33±1.25(1) 1.0 93.82 5.25±2.36(2)

　　注：与对照组相比(1)P<0.05，(2)P<0.01 2.3　茶多酚对皮肤角朊细胞周期动力学和凋亡的影响

　　从表3看出，随着茶多酚浓度增加，G1／G0(静止期)细胞百分数从81.32%下降到74.38%；G2／M(分裂期)细胞百分数从6.51%增至10.36%；S期(DNA合成期)细胞百分数从9.87%增加到15.26%，其增殖指数(PI)从18.17%上升到25.62%；而细胞凋亡的情况相反，从27.10%降低到17.97%(表3)。表3　茶多酚对皮肤细胞生长和凋亡影响 % 茶多酚(g/L) G0／G1 G2／M S PI 凋亡 0 81.81 6.67 11.53 18.20 22.98 0.1 81.32 6.51 9.87 18.17 27.10 0.5 81.76 8.37 12.17 18.24 20.45 1.0 74.38 10.36 15.26 25.62 17.97 3　讨　论

　　茶多酚是茶叶中最重要的活性成分之一，其化学名称为黄酮醇，又名儿茶素。主要包括下列4类：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，表没食子儿茶素(EGC)，表儿茶素表没食子酸酯(ECG)和表儿茶素(EC)。其不同组分对肿瘤细胞抑制作用不同，一般认为EGCG的抗肿瘤作用最强［5，6］，但也有研究报道以茶多酚混合物的作用更好［10］，故本次也采用茶多酚的混合物进行研究。有资料认为茶多酚的抗肿瘤作用与其介导肿瘤细胞凋亡的发生密切相关，通过细胞凋亡使肿瘤增生减慢而起到抑制肿瘤生长的作用［5～7，10］。同时，角朊细胞是皮肤表皮中含量最丰富的细胞组分，也是表皮更新、屏障和免疫功能的主要行使者之一，利用原代培养的皮肤角朊细胞进行细胞生理学、毒理学方面的研究，不仅可以较好的反映活体情况，而且具有快速、灵敏的特点［8］，可以避免整体动物实验操作中的诸多不稳定因素。

　　根据培养的皮肤角朊细胞的LDH释放情况，发现1 g/L左右的茶多酚对细胞膜没有损伤，可确定为进一步研究的剂量基础［9］。细胞生长情况的研究中显示，随着茶多酚浓度增加(小于1 g/L)，角朊细胞增长率由1.24%增加到5.25%；同时角朊细胞存活率也，从91.25%增至93.82%，细胞生长加速，可能也是死亡细胞数目相对减少原因之一。同时应用原代培养的皮肤角朊细胞进行细胞周期流式细胞仪分析，显示茶多酚能较好的促进皮肤角朊细胞从静止期(G0／G1)向DNA合成期(S期)和G2／M推进，表现为在一定程度上加速细胞更新换代和促进生长。皮肤角朊细胞凋亡研究中也发现，茶多酚对正常皮肤角朊细胞凋亡发生具有抑制作用，随着剂量增加抑制作用明显。细胞凋亡在保护细胞增殖与细胞丢失之间的平衡起到非常重要的作用，过度的细胞凋亡则引起退行性和老年性疾病等许多衰老症状，可见细胞凋亡与衰老之间有着较为密切的关系。茶多酚对正常细胞与肿瘤细胞凋亡影响差别的机理值得进一步探讨。

　　我们以往的研究也发现茶多酚可以抑制皮肤角朊细胞和成纤维细胞的脂质过氧化作用，其促进角朊细胞生长的机制可能与其清除自由基有关。同时根据文献报道，国内外已试图将茶多酚添加到多种化妆品中去，认为可以起到较好的护肤功效［7］。综上所述，我们认为在一定的浓度范围内，茶多酚可以清除自由基和抗脂质过氧化［1，3］，促进皮肤角朊细胞生长，维持细胞的增殖周期，防止细胞朝衰老／分化方向发展，可能具有延缓皮肤衰老的功效。当然，在整体动物中的具体效果和有效浓度仍需进一步探讨，因为正常皮肤还存在一个透皮吸收和血液循环稀释扩散作用等的影响。作者简介：符移才，男，博士研究生作者单位：符移才（上海医科大学预防医学研究所皮肤生理毒理研究室，上海　200032）

　　　金锡鹏（上海医科大学预防医学研究所皮肤生理毒理研究室，上海　200032）

　　　魏少敏（上海家化有限公司科研部）

　　　林惠芬（上海家化有限公司科研部）

　　　张英（浙江大学食品科技系）参考文献：［1］杨成峰，陈学敏，王桂珍，等.茶多酚清除自由基作用研究.中国公共卫生学报，1996，15(2)：87—88［2］刘尊永，金书香，秦汝莉，等.全茶、茶多酚和咖啡硷对小鼠生理功能影响的实验观察.中国公共卫生，1997，16(2)：91［3］Fang YZ， Sun CP， Tian XH， et al. Effect of lu-duo-wei on scavenging superoxide and hydroxyl radicals in vitro. Am J Chin Med， 1998，26(2)：153—158［4］韩驰，田江.茶叶防癌有效成分的筛选－茶多酚类.卫生研究，1995，24(4)：230—240［5］Fujiki H， Suganuma M， Okabe S. Mechanistic findings of green tea as cancer preventive for humans. Proc Soc Exp Biol Med， 1999，224(4):225—228［6］Liang YC， Lin-shiau SY， Chen CF， et al. Suppression of extracellular signals and cell proliferation through EGF receptor by (－)-epigallocatechin gallate in human A431 epidermaoid carcinoma cells. J Cell Biochem，1997，67(1):55－65［7］Fox C. Advances in the cosmetic science and technology of topical bioactive materials. Cos & Toil，1997，112：67—93［8］Yin L， Jin XP， Yu XZ， et al. Flow cytometric analysis of the toxicity of nitrofen in cultured keratinocytes. Biomed Environ Sci，1999，12:144—149［9］Bonnekoh B， Farkas B， Geisel J， et al. Lactate dehydrogenase release as an indicator of dithranol-induced membrane injury in cultured human keratinocytes. Arch Dermatol Res，1990，282：325—329［10］Suganuma M， Okabe S， Kai Y， et al. Synergistic effects of(－－)-epigallocatechin gallate with(--) -epicatechin， sulindac， or tamoxifen on cancer-preventive activity in the human lung cancer cell line PC-9. Cancer Res， 1999，59(1):44－47